第九节　天然药物常用分离方法

一、溶剂萃取法

1.溶剂萃取法的简介与原理

溶剂萃取法（extraction）是在提取液中加入一种与其不相混溶的溶剂，充分振摇从而增加两相接触的机会，使原提取液中的某种待分离成分逐渐转移到加入的溶剂中，而其他成分仍留在原提取液中，如此反复多次操作，将所需成分萃取出来的分离方法。

溶剂萃取法的原理是利用待分离的混合物中各组分在两种互不相溶的溶剂中的分配系数不同而实现分离的。根据分配定律，在恒定的温度和压力下，溶质在两相互不相溶的溶剂中达到分配平衡时，如果其在两相中的分子量相等，则其在两相中的浓度之比为常数，即分配系数K：

K=C_U/C_L　　（1-1）

式中，K代表分配系数；C_U代表溶质在上相溶剂中的浓度；C_L代表溶质在下相溶剂中的浓度。

混合物中各成分在同一萃取系统的两相溶剂中分配系数各不相同。萃取时若混合物中各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则萃取分离效果越好。我们用分离因子β来表示分离的难易，β为A、B两种溶质在同一溶剂系统中分配系数的比值，即：

β=K_A/K_B（K_A＞K_B）　　（1-2）

一般情况下，当β≥100时，仅需一次萃取即可达到基本分离；当10≤β＜100时，则需萃取10～12次才能达到分离；当β＜2时，则需100次以上萃取才能实现基本分离；当β≈1时，即表示两种物质分配系数相近，该溶剂系统无法实现分离。

2.溶剂萃取法的分类与选择

溶剂萃取法常分为简单萃取法、pH梯度萃取法和固相萃取法。

（1）简单萃取法　该法是实验室最常用的初步分离技术。简单萃取一般是在分液漏斗、下口瓶或萃取罐中进行，实验室小量萃取大多是在分液漏斗中进行（见图1-2-6），如果从水提液中萃取脂溶性成分，则可以选用环己烷、二氯甲烷或乙醚-水混合溶剂等。如果从水提液中萃取亲水性成分，一般选用乙酸乙酯、正丁醇等有机溶剂。

（2）pH梯度萃取法　pH梯度萃取法是通过依次改变溶液的pH，从而改变待分离物质的溶解度，利用液-液萃取实现有效分离的一种方法。其基本原理为：利用有机酸和有机碱在游离态和成盐态时溶解度的差别来实现的。

pH梯度萃取法通过逐级改变溶液的pH，从而使酸性强弱不同的有机酸或碱性强弱不同的有机碱得以分离。天然药物中蒽醌类、黄酮类、生物碱类化合物均可采用此方法进行分离。例如采用pH梯度萃取法分离酸性强弱不同的黄酮类成分时，可用pH由低至高的碱性缓冲溶液作萃取剂依次萃取，可使酸性由强到弱的黄酮类成分被分别萃取出来。

（3）固相萃取法　固相萃取法（solid-phase extraction）是近年来发展起来的一种样品预处理技术，该技术是由液固萃取和液相色谱技术结合发展而来，主要用于样品的分离、纯化和浓缩。固相萃取的原理就是利用固体吸附剂将液体样品中的目标化合物吸附而留在固体表面，其他干扰组分则随样品母液通过萃取柱，然后再用适当的洗脱液将目标化合物洗脱下来，从而达到分离和富集目标化合物的目的。固相萃取作为样品前处理技术，在实验室中得到了越来越广泛的应用。相对于传统的液-液萃取法，固相萃取可以提高目标化合物的分离率，优化样品的预处理过程。

二、结晶和重结晶技术

1.结晶和重结晶的简介与原理

结晶法（crystallization）是分离和精制固体化学成分最常用的方法。其利用混合物中各成分在某种溶剂或某种混合溶剂中溶解度的不同来达到分离的目的。在结晶操作中，样品溶解后需趁热过滤，以除去不溶性杂质，之后滤液冷置析晶并再次过滤，在得到所需晶体的同时，也将可溶性杂质留在滤液里。因此，通过一次结晶操作，不仅可以除去不溶性杂质，又可除去可溶性杂质，从而使固体样品得到纯化。而重结晶（recrystallization）是将晶体溶于溶剂或熔融以后，又重新从溶液或熔体中结晶的过程。一般来讲，结晶和重结晶没有本质区别，除了处理的原料有所不同外，操作原理和方法基本相同。但结晶状化合物在反复重结晶过程中，结晶析出的速度将越来越快，纯度也会越来越高。

天然药物化学成分在常温下多呈固体状态，可采用结晶法达到分离和精制的目的。在获得晶体后，能够有效地制成单体化合物，用于结构的鉴定，因此，获得结晶并纯化至单体是鉴定天然药物化学成分、研究其分子结构的重要途径。但值得注意的是，虽然能结晶的物质大部分是较纯的化合物；但并不意味该物质一定是单体，其也有可能是混合物。此外，有些物质即使达到了很高的纯度，也不一定能结晶或者不容易结晶，只呈现无定形粉末状态。这种情况往往需要制备结晶性的衍生物或盐来进行精制，如生物碱可制备成各种盐类，羟基化合物可制成乙酰化物或苯甲酰化合物；然后将结晶性衍生物或盐经结晶法精制，再用化学方法处理使其恢复原来的状态，进而提高化合物纯度。当然，某些无法结晶的化合物，在通过一系列检查后，确证其为单一化合物时，也可直接进行化学鉴定和化学结构的测定工作。

2.结晶法的操作步骤

结晶法的操作通常包括溶解、热滤、析晶、过滤四个步骤。

（1）溶解　将需要结晶处理的固体物质或粗晶溶解于沸腾或近于沸腾的适宜溶剂中。操作时可在三角瓶中进行，若为挥发性较大或沸点较低的有机溶剂，则可在装有回流冷凝装置的圆底烧瓶或三角瓶中进行。为了防止样品留在母液中而造成损失，加入溶剂的量应尽可能少，并且应将溶剂加热至沸腾或近于沸腾，使溶剂产生最大的溶解度，以利于冷却后过饱和溶液的形成和结晶的析出。

（2）热滤　由于溶解样品的溶液是一个热的过饱和溶液，遇冷极易析出晶体，因此必须趁热过滤，以除去不溶性杂质。过滤前可先用溶剂润湿并温热过滤漏斗和滤纸，必要时要保温过滤。过滤时应将热溶液分次倾入漏斗，以防在漏斗上冷却而析出结晶。结晶溶液如含胶状物质，可在滤纸上加一层硅藻土或石棉等助滤剂，防止滤纸堵塞。

（3）析晶　将滤液静置，慢慢冷却，待晶体析出。在这一过程中，溶液浓度高、降温快，将导致析晶速度变快，但此时结晶的颗粒较小，杂质也可能较多。如若析晶速度太快，超过了化合物晶核的形成和分子定向排列速度，则只能得到无定形粉末。同时，过高的溶液浓度也会导致溶液中杂质浓度或溶液黏度的增大，反而阻碍结晶的析出。因此，在操作中只有溶液浓度适当，并慢慢降低温度，才能析出结晶较大并且纯度较高的晶体。

（4）过滤　在该过程中，将采用抽滤法滤出所得结晶，并用少量冷的溶剂进行洗涤，以便除去沾附在晶体表面的母液。操作时先把母液抽干，将结晶压紧，尽量抽除母液，然后停止抽气，加入少量冷的溶剂浸泡片刻，再抽滤。如此反复多次，每次溶剂用量不宜过多。最后一次洗涤后，尽量抽干溶剂，取出结晶干燥即得。

3.结晶溶剂的选择

在结晶过程中，除了以上四个步骤的正确操作以外，还要特别注意结晶条件的选择，其中又以结晶溶剂的选择最为重要，一般应符合以下几点：

①溶剂对有效成分的溶解度随温度的变化应越大越好。即加热时溶解度大，可以使有效成分充分溶解；而冷却时溶解度变小，使有效成分尽可能完全析出。

②溶剂对杂质的溶解度随温度的变化应越小越好。也就是说，如果冷热都不溶，可作为不溶性杂质除去；如果冷热都易溶，则作为可溶性杂质除去。

③溶剂的沸点不宜过高或过低。沸点过低，溶剂容易挥发，难以控制某些可溶性杂质的析出；沸点太高，则不便浓缩，附在结晶上也不易除去。

④溶剂应不与欲结晶成分发生化学反应。

使用单一溶剂不理想时，可选用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂。一般先用溶解度大的溶剂加热溶解样品，然后向溶液中滴加溶解度小的第二种溶剂至浑浊，加热使澄清，若不能澄清，可再滴加第一种易溶溶剂，至浑浊全部变澄清为止，静置等待析晶。选择溶剂时，一般希望第一种溶解度大的溶剂其沸点低于第二种溶剂。冷置析晶时，低沸点溶剂较易挥发，比例逐渐减少，溶液易达到过饱和状态，有利于结晶的形成。

4.结晶纯度的判定

（1）观察结晶的形状、色泽，测定熔点　纯结晶性化合物都具有一定的晶型和均匀的色泽，而在不同溶剂中得到的结晶形状、熔点可能有所不同。单纯化合物结晶的熔距应在0.5℃左右，但由于结晶结构的原因，可允许在1～2℃范围内。应注意，有些化合物仅有分解点，而熔点不明显。

（2）色谱检测　可采用薄层色谱对结晶物的纯度进行判定。用三种以上不同展开系统展开时，若均显示单一斑点，一般表示为单一化合物。但也有例外，对于立体异构的混合物，尤其是手性化合物的混合物，可制备成衍生物再进一步鉴定。

三、薄层色谱技术

1.薄层色谱的简介与原理

薄层色谱（thin layer chromatography，TLC），也称薄层层析，是将吸附剂均匀地铺在载体（玻璃板、聚酯薄膜、铝箔等）上，把欲分离分析的样品点样加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂系统展开，在一定条件下显色或在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、分析、鉴定和定量的目的。

薄层色谱具有价廉、设备简单、操作容易、展开时间短、灵敏度和分辨率高、可使用腐蚀性显色剂等优点，已成为分离鉴定中药有效成分有无的常用方法之一。在分离中药有效成分过程中，通过薄层色谱的斑点变化可以指示分离的效果。此外，薄层色谱还可以用于指导选择柱色谱的溶剂系统。

2.薄层色谱的分类与选择

薄层色谱的吸附剂种类较多，能用于柱色谱的各种吸附剂、支持剂，如硅胶、氧化铝、聚酰胺、硅藻土、纤维素、淀粉等，均可用作薄层色谱的吸附剂或支持剂。其中，由于硅胶、氧化铝、聚酰胺的吸附性能良好，适用于各类化合物的分离，应用十分广泛。

（1）硅胶　硅胶是一种常用的极性吸附剂。它可用通式SiO₂-xH₂O表示，具有多孔性的硅氧环交联结构，其骨架表面的硅醇基能通过氢键与极性或不饱和分子相互作用。硅胶的吸附性能取决于硅胶中硅醇基的数量和含水量。随着水分的增加，吸附能力下降。若吸水量超17%，只可用于分配色谱的载体。当硅胶加热到100～110℃时，其表面所吸附的水分能被可逆地除去，因此通过加热的方式可活化硅胶。但活化温度不宜过高，以防止硅胶表面的硅醇基脱水缩合转变为硅氧烷结构而失去吸附能力，一般以105℃活化30min为宜。

硅胶吸附色谱是使用最为广泛的一种色谱，天然药物各类化学成分大多用其进行分离，尤其适用于中性或酸性成分的分离。

（2）氧化铝　氧化铝也是一种常用的极性吸附剂，由氢氧化铝在高温下（约600℃）脱水制成得。色谱用氧化铝有碱性、中性、酸性三种。

氧化铝吸附色谱的应用范围有一定的限制，主要用于分离碱性或中性亲脂性成分，如生物碱、甾体、萜类等成分。但氧化铝对树脂、叶绿素及其他杂质的吸附能力较强，常用于提取物的预处理，去除部分杂质，以便后续的纯化和分离。

（3）聚酰胺　聚酰胺是通过酰胺键聚合而成的一类高分子化合物，分子中含有丰富的酰胺基。由于其酰胺键与酚类、酸类、醌类、硝基化合物等形成氢键的数目不同、强度不同，故聚酰胺对这些化合物产生不同强度的吸附作用。聚酰胺分子中既有极性的酰胺基团，又有非极性的脂肪键，因而具有双重色谱的性能。当用含水流动相时，聚酰胺作为非极性的固定相，其色谱行为类似反相色谱，苷比苷元先洗脱。当用不含水流动相时，聚酰胺作为极性的固定相，其色谱行为类似正相色谱，苷元比苷先洗脱。

3.薄层色谱的操作技术

（1）展开剂的选择　薄层色谱展开剂的选择主要是根据吸附剂的性能、样品的附着力、样品的溶解度和溶剂的极性等因素来考虑。也可以参照文献经验，根据同类化合物的展开剂来选择合适的溶剂系统，并亲自实践调整。此外，如果样品在溶剂中溶解度很大，原点将变成空心圆，影响随后的线性展开，所以原则上应选择对被测成分可以溶解但溶解度不是很大的溶剂。如果溶解样品的溶剂在原点残留，将会改变展开剂的选择性。若为亲水性溶剂残留在原点，会吸收大气中的水分，将对色谱质量产生影响，因此除去原点残存溶剂是必要的。

（2）点样

①点样方式　分为自动点样和手动点样。自动点样采用半自动点样仪或全自动点样仪，按预设程序自动点样。手动点样最常采用的器具为微量毛细管，灵活方便，常用于各种TLC鉴别中。点样前先在离薄层板一端1.0～1.5cm处，用铅笔轻轻地画一条线作为点样线。采用边点样边用吸耳球吹干溶剂的方式。在同一原点进行多次点样时，要尽可能使每次的点样环中心重合、直径大小一致，以免形成多个环状。点样环在原点的不均匀分布将使展开后的色谱图带不够清晰和整齐。操作过程应注意小心用点样器垂直接触薄层板表面以防止损伤板面。若薄层吸附剂表面被损坏或点成洼孔，则展开后斑点成不规则形状，将影响测定结果。

②点样量　原点位置对样品容积的负荷量有限，体积不宜太大。一般对250nm厚薄的薄层板，每点所含样品质量为5～15μL，通常配成1%～2%的点样浓度。点样量太小，不能检出清晰的斑点从而影响判断；点样量太多或者太浓，斑点脱尾或重叠，将会降低分离效率。当点样量适合时，可采用点状点样。在一块薄层板上如果需要点几个样品时，样品的间隔在1cm为宜，而且各斑点需要点在同一水平线上。当点样量过大，原点无法负荷时，可采用条带状点样，这样会得到更好的分离效果，提高分辨率。

（3）展开

①展开剂的配制　配制展开剂时，应严格控制其比例准确度。展开剂配好后如果浑浊不清，不能立即使用，应转移入分液漏斗中，待其静置分层澄清后再取其上层或下层液进行展开。

②展开剂的用量　展开剂的用量以薄层板放入的深度距原点5mm为宜，切勿倒入过多，以防原点浸入展开剂，成分将被展开剂溶解而不随展开剂在薄层板上分离。

③溶剂蒸气的作用　溶剂蒸气在薄层色谱中起着重要作用，它和流动相（展开剂）、固定相（吸附剂）一起构成了一个作用机制复杂的三维层析过程。为了克服溶剂蒸气的影响，可将点好样的薄层板在展开剂的蒸气中预饱和15～30min。待展开至规定距离（一般为溶剂展开至薄层板的3/4高度），取出薄层板，标记溶剂前沿，晾干。

（4）显色　一般薄层展开结束后，先在日光下观察有无有色的斑点，然后再在紫外光下观察有无荧光斑点，最后再用显色剂显色。显色方式有喷雾显色、浸渍显色和蒸气显色。实验中最常用的是喷雾显色。喷雾显色是将显色剂用喷雾的方法均匀喷于薄层板上，操作时要尽可能控制液滴细微，同时使板各部位的喷雾密度尽可能一致。显色剂的量要适当，太多则烘干时间延长，使斑点显色时间延长，多余显色剂流向薄层板下方，容易产生斑点变形；太少则斑点反应不完全。

（5）检视与记录　样品经色谱分离后，通常用比移值（R_f）表示物质移动的相对距离。

　　（1-3）

R_f随分离化合物的结构、固定相、流动相的性质、温度等多种因素的不同而变化。当各因素固定时，R_f就是一个特定的常数，因而可以作为定性分析的依据。在实际工作中，由于影响因素太多，实验数据往往与文献报道的不完全一致，因此在化学成分的鉴定时常常采用与化学对照品共薄层同步展开的方法来分析。

薄层图谱应及时进行检视和记录，以避免图谱因环境因素发生变化。尽可能以光学照片或电子图像的形式保存。紫外光下拍摄图谱时，应使用滤光片滤除紫外光，以免图谱与肉眼观察间存在色差，确保实验记录的真实完整。

四、硅胶柱色谱技术

1.硅胶柱色谱的简介与原理

硅胶（silica gel）是硅酸部分脱水后的产物，其成分是SiO₂-xH₂O，为多孔无定形或球状颗粒，其表面存在着硅醇基团（—Si—OH）和暴露的硅氧烷键（—Si—O—Si—）。硅胶呈化学惰性且具有较大的吸附量，易于制备成不同类型、孔径、表面积，因而广泛应用于吸附色谱中。它是液-固吸附色谱的主要固定相，也是液-液分配色谱最重要的载体。通过化学修饰对硅胶表面进行改性，得到的各种化学键合相，可适用于不同分离模式。

在一定条件下，硅胶与被分离物质之间产生物理和化学作用。物理作用来自硅胶表面与待分离物质之间的范德华力；化学作用主要是硅胶表面的硅醇基团与待分离物质之间的氢键作用。一般情况下，在硅胶柱色谱中，与固定相产生强相互作用的样品分子比较难被洗脱，在柱内停留的时间较长。反之，与固定相产生较弱相互作用的样品分子比较容易被洗脱，因而在柱内停留的时间较短。

硅胶柱色谱具有柱效高、选择性好及分析速度快等特点，因而被广泛应用于中草药化学成分的分离提纯以及高纯度物质的制备等。

2.硅胶的分类和选择

根据硅胶表面是否通过化学修饰进行改性，可以分为硅胶和键合硅胶。

（1）硅胶　硅胶是最常用的正相色谱填料，按其粒径大小，分为100～200目、200～300目和300～400目等规格。其中100～200目的硅胶常用于粗提物的分段以及简单样品的分离，且只需常压操作。而粒径更小的硅胶分离效率更高，常用于分离度较小的样品的分离，但往往需要加压操作。由于硅胶表面的硅醇基团极性较强，因此，在分离过程中极性较弱的组分最先被洗脱出色谱柱。

硅胶是一种酸性吸附剂，适用于芳香油、萜类、甾体、黄酮、蒽醌类等中性或者弱酸性成分的分离。由于碱性物质能与硅胶作用，易发生拖尾甚至一定的死吸附，故硅胶不适用于碱性物质的分离。硅胶柱色谱常用的洗脱剂为单个或者多个溶剂的混合溶液。单一溶剂的极性大小顺序如下：

石油醚＜环己烷＜二氯甲烷＜氯仿＜乙酸乙酯＜丙酮＜正丙醇＜甲醇＜水

（2）键合硅胶　键合硅胶是以硅胶为基质，借助化学方法，将不同的有机官能团以共价键的形式连接到硅胶表面的硅醇基团上。键合硅胶因其良好的机械强度、化学稳定性和热稳定性，在生物、化学、医药等领域的分离分析工作中广泛应用。根据键合官能团极性的不同，键合硅胶主要分为非极性键合相硅胶和极性键合相硅胶。

非极性键合相硅胶是指在硅胶表面键合非极性或者弱极性的烃基，如十八烷基（—C₁₈）、辛烷基（—C₈）与苯基（—Phenyl）等。其中十八烷基硅烷键合硅胶（octadecylsilyl，简称ODS），也称C₁₈，以柱效高、分离性好、适用性广，已成为此类填料的代表，广泛应用于反相色谱。由于ODS表面的键合相基团极性较弱，因此，样品流出色谱柱的顺序是极性强的组分最先被洗脱，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。ODS柱色谱常用于中等或大极性成分的分离，流动相通常为水和色谱有机试剂的混合溶液，最常用的组合溶剂是“甲醇-水”和“乙腈-水”。单一溶剂的冲洗强度如下：水＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃。随着ODS柱可分离样品种类的增多和应用范围的扩大，其流动相系统通过适当调整pH或加入盐类物质或相反的离子、维持较高的缓冲浓度等，可产生改善洗脱时间和峰形的效果。其中醋酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液在流动相系统中比较常用，但是要注意的是，对于ODS柱这一类非极性键合相色谱柱，流动相切勿pH＜2或pH＞7。

极性键合相硅胶是指在硅胶表面键合极性较强的有机官能团，如氨基（—NH₂）、氰基（—CN）、二醇基［—CH（OH）CH₂OH］及硝基（—NO₂）等。极性键合相硅胶大多数用于正相色谱，少数可用于反相色谱。其在用于正相色谱时，需用低极性流动相，如正己烷等，适用于一些小极性或中等极性成分的分离。在用于反相色谱时，需用强极性流动相，如“甲醇-水”和“乙腈-水”等，适用于一些大极性成分的分离。

3.硅胶柱色谱的操作技术

由于硅胶与键合硅胶性质的差异，因此二者的柱色谱操作方法也有所不同，在此选择具有代表性的硅胶柱色谱和ODS柱色谱分别介绍其操作方法。

（1）硅胶柱色谱

①装柱　色谱柱的规格由待分离样品的量和吸附难易程度来决定。一般柱管直径为0.5～10cm，长度为直径的10～40倍。填充吸附剂的量为样品质量的20～50倍，柱体高度应占柱管高度的3/4，柱子过于细长或过于粗短都不利于样品分离。装柱前，柱子应洗净、干燥，并取一小团脱脂棉用溶剂润湿后塞入管中，用一长玻璃棒将其轻轻送到底部，适当捣压，赶出棉团中的气泡，但不能压得太紧，以免阻碍溶剂畅流（如管子带有筛板，则可省略该步操作）。接着将柱子垂直固定在铁架台上，再往柱内的脱脂棉上面加入一层约0.5cm厚的洁净硅胶，并从对称方向轻轻叩击柱管，使砂面平整。

常用的装柱方法有干法装柱和湿法装柱两种。

a.干法装柱　首先，在柱内装入2/3体积的初始洗脱剂，接着在管口上放一漏斗，把硅胶经漏斗以细流状倾泻到管柱内。同时用套在玻璃棒（或铅笔等）上的橡皮塞轻轻敲击管柱，使硅胶均匀地沉降到底部。其次，填充完毕后，用滴管吸取少量初始洗脱剂把黏附在管壁上的硅胶颗粒冲入柱内，继续敲击管柱直到柱体不再下沉为止。最后，打开层析柱底部的活塞，并用锥形瓶收集流出的洗脱剂，将柱体上层液面高度降至0.1～1cm。再把收集的洗脱剂反复循环通过柱体几次，便可得到沉降紧实的柱体。

b.湿法装柱　该方法与干法装柱类似，所不同的是，装柱前硅胶需要预先用初始洗脱剂调成淤浆状，在倒入淤浆时，应尽可能连续均匀地一次完成。如果柱子较大，应事先将硅胶泡在一定量的初始洗脱剂中，并充分搅拌后过夜（排除气泡），然后再装柱。

无论是干法装柱，还是湿法装柱，装好的色谱柱应充填均匀、松紧适宜一致，没有气泡和裂缝；否则会造成洗脱剂流动不规则而形成“沟流”，引起色谱带变形，从而影响分离效果。

②上样　常用的上样方法有干法上样和湿法上样两种。

a.干法上样　把待分离的样品用少量挥发性强的有机溶剂溶解后，再加入等量的硅胶中，搅拌均匀后挥去溶剂。如此得到的样品硅胶粉末再小心加到色谱柱的顶层，并保证样品层平整。干法上样适用于一些溶解性差或量大的样品。

b.湿法上样　用少量极性较小的溶剂（最好就是洗脱剂，如果洗脱剂的溶解度不好，则可以用极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管沿着色谱柱内壁均匀加入样品溶液。然后用少量洗脱剂将容器和滴管冲洗净并全部加到柱内，再用洗脱剂把黏附在管壁上的样品溶液淋洗下去。慢慢打开活塞，调整液面和柱面相平为止，再关好活塞。湿法上样适用于溶解性较好或量少的样品。如果样品是液体，还可直接加样。

无论是干法上样，还是湿法上样，上完样后，须在样品层上面再铺一层干净的硅胶并塞一团脱脂棉以保护样品层在补充洗脱剂时不被冲散。

③洗脱与检测　将选好的洗脱剂沿柱管内壁缓慢地加入色谱柱内，直到充满为止（注意勿冲起柱面覆盖物）。打开活塞，让洗脱剂慢慢流经柱体，洗脱开始。在洗脱过程中，注意随时添加洗脱剂，以保持液面的高度始终高于柱面。在进行大柱洗脱时，可在柱顶连接一个储液球，这样可以随时加液，保证柱内洗脱剂充足。如果采用梯度溶剂洗脱，则应从极性最小的洗脱剂开始，依次增加极性，并记录每种溶剂的体积，直到最后一个成分流出为止。洗脱的速度也是影响分离效果的一个重要因素。大柱一般调节在每小时流出的毫升数等于柱内吸附剂的克数。中小型柱一般以1～5滴/秒的速度为宜。

在洗脱液的收集过程中，有色物质，按色带分段收集，两色带之间要另收集，可能两组分有重叠。对无色物质的接收，一般采用分等份连续收集，每份流出液的体积毫升数等于吸附剂的克数。若洗脱剂的极性较强，或者各成分结构很相似时，每份收集量就要少一些。具体收集量体积的确定要通过薄层色谱检测，视分离情况而定。洗脱完毕，采用薄层色谱对各收集液进行鉴定，把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，从而达到分离目的。

（2）ODS柱色谱

①装柱　ODS柱色谱属于反相色谱，所用流动相极性较大，黏度也较大，所以通常用加压或减压柱。新购的ODS，需用甲醇浸泡过夜后，方可装柱使用。开放 ODS柱色谱常用干法装柱，装柱方法与硅胶柱色谱基本相同。填充完毕后，用滴管吸取少量初始洗脱剂把黏附在管壁上的ODS颗粒冲入柱内，再用真空泵将柱内溶剂抽至减压柱底连接的接收瓶中，并把收集的初始洗脱剂反复循环通过柱体数次，便可得到紧实的柱体。

②上样　开放ODS柱色谱常用干法上样。由于ODS填料价格昂贵，需反复使用，为了防止填料被污染，需将两层直径与色谱柱直径相同的滤纸垫在柱内填料的顶端。上样前，样品溶解后需要用0.22μM的膜过滤，再加入等量的ODS填料中，搅拌均匀后除去溶剂。接着将得到的粉末小心加到色谱柱的顶层，并保证样品层平整。上完样后，在样品层上面铺一层干净的ODS填料并塞脱脂棉以保护样品层在补充洗脱剂时不被冲散。

③洗脱与检测　将选好的洗脱剂沿柱管内壁缓慢地加入柱内，直到充满为止，打开真空泵，让洗脱剂流经柱体，洗脱开始。在洗脱过程中，注意随时添加洗脱剂，以保持液面的高度恒定，特别应注意不可使柱面暴露于空气中。对于复杂样品，可采用10%、30%、50%、70%、100%的甲醇梯度洗脱。

ODS柱色谱的检测方法与硅胶柱色谱基本相同。洗脱完毕，需采用ODS薄层色谱或HPLC对各收集液进行鉴定，把含相同组分的收集液合并，除去溶剂，从而达到分离目的。

五、氧化铝柱色谱技术

1.氧化铝的简介与原理

氧化铝（alumina）与硅胶一样同属于极性吸附剂，其吸附能力比硅胶强，主要适用于亲脂性化合物的分离。氧化铝具有价廉、吸附力强、载样量大等优点，因此应用也较广泛。

氧化铝的分离原理主要为化合物与其表面通过四种作用力产生吸附作用，这四种作用力包括偶极-偶极相互作用、成盐作用、配位作用和氢键作用。需要注意的是，氧化铝对于含有羧基的化合物、酸性较强的酚类化合物会形成死吸附。同时，对于一些对碱性敏感的化合物，如内酯类、强心苷类、某些萜类等，易发生内酯环开裂、酯的水解、异构化、聚合等副反应。因此限制了氧化铝的使用，其主要用于一些对弱碱稳定的亲脂性成分特别是生物碱的分离和天然药物成分中杂质的脱除和精制。

2.氧化铝的分类与选择

工业用氧化铝是将氢氧化铝以不超过700℃加热煅制而成，因其含有少量碳酸钠而碱性太强，需要处理后才能使用。商品用氧化铝按制备方法不同分为三种：碱性氧化铝、中性氧化铝和酸性氧化铝。

（1）碱性氧化铝（pH 9.0～10.0）　取工业用氧化铝，加水煮沸处理至溶液的pH为9.0～10.0时得到碱性氧化铝。碱性氧化铝适合分离碱性成分（如生物碱），也适用于分离中性成分（如萜、甾体、强心苷类等）。但不适宜醛、酮、酸、内酯类等化合物的分离，因为碱性氧化铝可能与上述成分发生次级反应，如络合、异构化、氧化、消除反应等。

（2）中性氧化铝（pH 6.5～7.5）　中性氧化铝一般采用碱性氧化铝通过水洗或加入5%醋酸溶液处理以除去其碱性而得。中性氧化铝适用范围最广泛，适用于生物碱、萜、醛、酮、挥发油、甾体等中性物质的分离，以及对酸碱不稳定的苷类、内酯类成分的分离。

（3）酸性氧化铝（pH 4.0～4.5）　酸性氧化铝一般采用工业用氧化铝用7%盐酸酸化处理而得。不仅可中和氧化铝中含有的碱性杂质，并可使氧化铝颗粒表面带有Cl^-，从而具有离子交换剂的性质，适合于酸性成分的分离。酸性氧化铝适用于有机酸、酸性氨基酸和酚类等酸性物质，天然及合成酸性色素的分离，以及对酸稳定的中性物质的分离。

3.氧化铝柱色谱的操作技术

氧化铝柱色谱的一般操作技术、洗脱剂的选择等与硅胶柱色谱相似，可参考本节“硅胶柱色谱技术”的相关内容进行。

六、聚酰胺柱色谱技术

1.聚酰胺的简介与原理

聚酰胺是一类由酰胺键聚合而成高分子聚合物，聚酰胺既有半化学吸附即氢键吸附色谱的性质，又有分配色谱的性质，属于“双重色谱”吸附剂。

（1）“氢键吸附原理”学说　聚酰胺分子中存在着许多酰胺基（—CONH—），可以与酚类、酸类、黄酮类、醌类及硝基类化合物形成分子间氢键，形成氢键缔合而产生吸附，从而与不形成氢键的化合物分离。化合物与聚酰胺的吸附能力又因不同化学成分形成氢键的数目、强度不同而不同，洗脱溶剂通过改变聚酰胺对化学成分的氢键缔合能力将不同成分分离。聚酰胺的吸附强弱取决于各种化合物与聚酰胺形成氢键缔合的能力，在含水溶剂中主要有以下规律：①分子中能形成氢键的基团越多，吸附力越强；②成键位置对吸附力也有影响，易形成分子内氢键者，分子吸附力降低；③分子内芳香程度越高或共轭双键越多，吸附力越强，反之则减弱。

（2）“分配色谱原理”学说　随着聚酰胺色谱的不断扩展使用，有些分离结果无法用“氢键吸附原理”解释。如萜类、甾体、生物碱类、强心苷等化合物很难与聚酰胺形成分子内氢键，但它们也可以用聚酰胺色谱分离。因为在聚酰胺分子中既有非极性的脂肪链，又有极性的酰胺基团，因此具有“双重保留”机制。当采用极性洗脱剂（如水、含水甲醇等）时，聚酰胺作为非极性固定相，其色谱行为类似于反相分配色谱。当采用极性较小的非水流动相（如三氯甲烷-甲醇、乙酸乙酯-甲醇等）时，聚酰胺中的酰胺基和通过氢键吸附的水分子作为极性固定相，其色谱行为类似于正相分配色谱。对于能够形成氢键吸附的化合物，“氢键吸附原理”仍占主导作用。

聚酰胺是一种用途十分广泛的分离色谱，各种极性、非极性化合物均适用，特别适合于黄酮类、醌类、酚酸类等多元酚类化合物、含有羧酸以及含有羰基的化合物，此时，“氢键吸附原理”占主导作用。

2.聚酰胺的分类与选择

聚酰胺又称锦纶或尼龙，具有许多种类，其中色谱中最常用的锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）。锦纶6和锦纶66既有亲水的性质，又有亲脂的性质，故它们既可用于分离水溶性成分，又可用于分离脂溶性成分。此外，分子量的大小对聚酰胺的理化性质及色谱性能有很大的影响。分子量太小的聚酰胺，在常用的有机溶剂特别是含氯的有机溶剂中的溶解度较大，而且也不太稳定，在处理中易被酸碱所破坏。因此在处理过程中会污染分离的样品。分子量太大的聚酰胺，其亲水性和可塑性均较差，也不适合色谱使用。而锦纶6和锦纶66的分子量在16000～20000之间，熔点在200℃以上，分子量大小适中，故在色谱分离中最为常用。它们可溶于浓盐酸、甲酸、热冰醋酸，微溶于醋酸、苯酚等溶剂，不溶于水、甲醇、乙醇、丙酮、乙醚、三氯甲烷、苯等常用的有机溶剂，对碱较稳定，对酸尤其是无机酸稳定性较差。

3.聚酰胺柱色谱的操作技术

聚酰胺柱色谱的一般操作技术与硅胶、氧化铝等相似，可参考本节“硅胶柱色谱技术”的相关内容。

聚酰胺的填装通常采用湿法装柱，其载样量较大，每100mL聚酰胺一般可上样1.5～2.5g样品。聚酰胺柱色谱使用的洗脱剂系统可分为两大类，即氢键吸附色谱用洗脱剂和分配色谱用洗脱剂：①当主要为氢键吸附色谱时，常用的洗脱剂为含水极性溶剂系统，如递增的不同浓度的乙醇水溶液，使其洗脱能力不断增加。若仍有组分未洗脱，可采用稀氨水或稀甲酰胺溶液洗脱，分段收集。聚酰胺色谱常用的洗脱剂洗脱能力从弱到强为：水＜甲醇或乙醇（浓度由低到高）＜丙酮＜稀氢氧化钠水溶液或氨水＜甲酰胺＜二甲基甲酰胺＜尿素水溶液。②当主要为分配色谱时，常用的洗脱剂为极性较小的有机溶剂系统，与硅胶、氧化铝柱色谱相似。值得注意的是，含氯的溶剂对聚酰胺聚合物本身具有一定的溶解相，容易污染样品，应尽量避免使用。

聚酰胺薄层色谱是寻找聚酰胺柱色谱分离条件和检查柱色谱各流分组成和纯度的重要手段，通常采用商品聚酰胺薄膜。展开溶剂既可采用含水极性溶剂系统，也可采用极性较小的有机溶剂系统。

七、凝胶柱色谱技术

1.凝胶柱色谱的简介与原理

凝胶是一种不带电具有多孔隙的三维网状结构的多聚体，在水中可膨胀，其特点为操作方便，可循环使用，无损失的分离和纯化，对多种天然产物有良好的分离和纯化效果。

凝胶色谱的分离原理为分子筛原理，根据凝胶的孔径和被分离化合物的分子大小不同而达到分离目的。当样品分子溶液通过凝胶柱时，各组分在柱内的保留程度取决于分子量大小。小分子可以渗透进入凝胶内部空隙中而被滞留，中等分子可部分进入，大分子则完全不能进入。因此各组分按分子量由大到小的顺序进行洗脱分离，这种效应称为“分子筛效应”，因此凝胶色谱又称为分子排阻色谱、凝胶过滤色谱、凝胶渗透色谱等。凝胶色谱分离过程见图1-2-7。

2.凝胶的分类与选择

常用于分离天然产物的凝胶，按其骨架的化学结构特点和洗脱溶剂适用范围，可分为葡聚糖凝胶（Sephadex G）或羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）。

（1）葡聚糖凝胶（Sephadex G）　此类凝胶又称交联葡聚糖，由平均分子量一定的葡聚糖和交联剂（3-氯-1，2-环氧丙烷）通过醚键的形式相互交联而成的三维多孔性网状结构。凝胶因其结构中具有多羟基而极性大，能吸水膨胀成胶粒。由于醚键的不活泼性，又具有较高的稳定性。Sephadex G型凝胶不溶于水及稀酸碱溶液，仅适用于流动相为水的色谱分离，适合于水溶性成分如多糖、蛋白质和肽类的分离。因其在有机溶剂如甲醇、乙醇中易溶解，限制了其用于分离水溶性差的成分。市售的商品凝胶型号按交联度大小分类，并以吸水量多少表示，不同规格适用于分离分子量不同的物质。以Sephadex G-25为例，G为凝胶，后附数字表示该型号的干凝胶每1g吸水量乘以10，即G-25表示此干凝胶吸水量为2.5mL·g^-1。此外，商品型号还有G-10、G-15、G-50、G-75等。型号数字越大，吸水量越大，凝胶体积膨胀越大，孔隙也越大，可用于大分子物质的分离；反之，可用于小分子物质的分离。

（2）羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）　此类凝胶是在Sephadex G-25分子中经羟丙基化处理后的产物，即ROH→ROCH₂CH₂CH₂OH。与Sephadex G相比，其分子中羟基总数不变，但碳原子所占比例相对增加，因此亲脂性增强，具有亲脂和亲水双重特性，故不仅可以在水中使用，也可以在极性有机溶剂或含有机溶剂的水中使用。可用于极性较小化合物的分离。另外，Sephadex LH-20除了保留葡聚糖凝胶原有的分子筛特性，可以根据分子量大小分离物质外，在极性与非极性溶剂组成的混合溶剂中也能起到反相分配色谱的效果。Sephadex LH-20适用于不同类型天然产物的分离纯化，如黄酮、生物碱、蒽醌、香豆素、皂苷等。

3.凝胶柱色谱的操作技术

（1）凝胶及样品的预处理　商品化的交联葡聚糖凝胶通常为干燥的颗粒，使用前必须浸入洗脱液充分溶胀。如溶胀不彻底，装柱后，凝胶会继续溶胀，导致色谱柱不均匀，影响色谱分离效果，甚至会造成色谱柱的胀裂。

样品采用尽可能少的水或者洗脱液溶解，由于其中的杂质较多，容易污染堵塞凝胶柱。此时可将样品过滤或离心，除去不溶性杂质，防止样品中的一些沉淀物污染凝胶。这样既能提高纯化率，也能起到保护凝胶的作用。

（2）凝胶的装柱　将色谱柱垂直安装于铁架台上，在柱顶部连接一个长颈漏斗，在搅拌状态下向色谱柱内缓缓加入凝胶悬浮液，同时打开色谱柱下口，维持适当的流速。凝胶颗粒在柱中均匀地沉积，直到达到所需高度为止。拆除漏斗，用较小的滤纸片盖住凝胶柱床表面，用大量的水或洗脱液洗涤过夜。

（3）凝胶柱的上样、洗脱与收集　装好的色谱柱至少使用相当于3倍量的洗脱液平衡，待平衡液与柱床表面平行时，关闭出口。将需要分离的样品制成澄清的上样液，用胶头滴管吸取样品溶液，在床表面上约1cm高度，沿色谱柱柱壁加入样品溶液。再打开色谱柱的下口活塞，使样品完全渗入凝胶柱内，再关闭出口。在柱床上面覆以薄层脱脂棉，以保护柱床表面。然后加入洗脱液进行洗脱。凝胶柱色谱的洗脱较慢，每份的体积较小，收集的流分较多，最好能与自动收集器相连。样品检识以薄层检出为主。

（4）凝胶的再生　凝胶色谱填料在分离后用洗脱液稍加平衡即可进行下一次色谱。但有时往往有一些污染物沉积在柱床表面或是凝胶柱床表面颜色改变，此时可将表层凝胶用刮刀去掉，加一些新溶胀的凝胶再进行平衡。如果整个色谱柱有微量污染，可用0.8%氢氧化钠和0.5mol·L^-1氯化钠溶液处理。色谱柱经多次反复使用后，如果色谱柱床污染严重，则需要将凝胶再生，重新装柱后方可使用。凝胶再生的方法为用50℃左右的2%氢氧化钠和0.5mol·L^-1氯化钠的混合液浸泡后，再用水洗至中性，即可。

八、大孔吸附树脂柱色谱技术

1.大孔吸附树脂的简介与原理

大孔吸附树脂（macroporous adsorption resin）是一类具有大孔网状结构的高分子聚合物吸附剂，是20世纪60年代继离子交树脂后的新型分离介质。在化学结构上，它与离子交换树脂相似，不同之处在于它不存在酸性或碱性基团。

大孔吸附树脂的分离原理是吸附性和分子筛性相结合。它的吸附性与树脂表面的孔径吸附、表面电性、范德华力或氢键有关；分子筛性与其良好的三维网状结构和很大的比表面积有关。大孔吸附树脂的理化性质稳定，机械强度高、热稳定性较好，在常温下，不溶于任何酸、碱、亲水性有机溶剂。同时它具有选择性好、吸附速度快、吸附容量大、解析和再生处理方便等优点，使用寿命长。

大孔吸附树脂近年来被广泛应用于中草药化学成分的分离与富集工作，适用于多种有效成分或有效部位的分离纯化，如多糖和苷类物质的分离；黄酮苷、生物碱和三萜类化合物的分离等。

2.大孔吸附树脂的分类与选择

按大孔吸附树脂骨架的化学结构特点和易吸附化学物质的性能，可分为非极性、弱极性、中极性、极性大孔树脂四类，常见的商品大孔吸附树脂型号及性质见表1-2-1。

（1）非极性大孔吸附树脂　该类树脂是由偶极矩很小的单体聚合制得的树脂，如由苯乙烯和二乙烯苯缩合而成，故又称芳香族吸附树脂，不带任何功能基，孔表面的疏水性较强，最适用于由极性溶剂（如水）中吸附非极性物质。这类非极性大孔吸附树脂应用最为广泛。

（2）弱极性大孔吸附树脂　该类树脂是指由苯乙烯（或甲基苯乙烯）、二乙烯苯及少量极性单体（如丙烯酸酯等）共聚而成。由于加入的极性物质在吸附树脂内分布较为均匀，因此这类树脂对分离纯化对象的亲水部分和疏水部分均有一定的吸附，吸附性能更为全面，使用方法与非极性大孔吸附树脂相同。

（3）中极性大孔吸附树脂　该类树脂是由甲基丙烯酸酯和甲基丙烯酸乙二醇酯等中极性单体聚合而成，是含有酯基的吸附树脂，其表面兼有疏水和亲水两部分。既可在极性溶剂中吸附非极性物质，又可在非极性溶剂中吸附极性物质。

（4）极性大孔吸附树脂　该类树脂主要是指含有氰基、酰氨基、亚砜基、吡啶基、氨基等极性基团的吸附树脂，主要通过静电相互作用吸附极性物质，从非极性溶液中吸附极性物质。

3.大孔吸附树脂柱色谱的操作技术

（1）大孔吸附树脂的预处理　由于商品大孔吸附树脂常含有未聚合的单体、致孔剂、交联剂、分散剂、防腐剂和残留的有机溶剂等，主要为脂溶性物质，对人体有害，为了保证用药安全，故在使用前必须经过预处理除去。此外，大孔吸附树脂一般具有60%～75%的含水量，用水湿润主要是保护其内部结构不被破坏。在储存过程中有可能会因失水而缩孔，故通过合理的预处理方法还可以使树脂的孔得到最大限度的恢复。

将大孔吸附树脂置于容器中用水洗2～3次，浸于乙醇中，浸泡12h后装柱。再用乙醇以每小时2倍柱体积的流速通过树脂层，洗至洗出液1mL加纯化水9mL不显白色浑浊为止，再用蒸馏水以同样流速洗净乙醇。

（2）样品的预处理　需经大孔吸附树脂处理的样品往往是用热水、适当浓度的乙醇或其他溶剂提取出的提取液，杂质较多，容易污染堵塞树脂。此时可将样品过滤、沉淀、调节pH等处理，除去部分杂质，制成澄清的上样液，这样既能提高纯化率，也能保护树脂的使用寿命。或者将样品先溶于少量有机溶剂中，以适量树脂拌样，挥去溶剂后，再将拌有样品的树脂加到柱上。

（3）大孔吸附树脂的装柱　大孔吸附树脂通常是以水为溶剂进行湿法装柱。将大孔吸附树脂置于烧杯中，加水后充分搅拌，赶尽气泡。放置几分钟待大部分树脂沉降后，倾倒去上面的泥状微粒。反复上述操作直到上层液透明为止。因为粒度小的树脂较难沉降，故搅拌后放置的时间要较长一些，若急于将上清液倒掉，往往损失较大。

将色谱柱垂直固定在铁架台上，在色谱柱的底部放少许薄脱脂棉，在上述准备好的树脂中加入少量的水，搅拌后倒入垂直的色谱柱中，使树脂沉降，让水流出。如果把粒度大小范围较大的树脂和多量的水搅拌后分几次倒入，则色谱柱上下部的树脂粒度往往会不一致，影响分离效果，故最好一次性将树脂倒入。此外，装柱过程中不要让气泡进入色谱柱。如有气泡进入，样品溶液与树脂的接触就不均匀，同样影响分离效果。最后，在色谱柱的顶部加一层干净的脱脂棉，以免加液时把树脂冲散。注意尽量使色谱柱填装均匀，忌搅动、干柱床、空心柱与气泡柱。

（4）大孔吸附树脂的上样、洗脱与收集　将水放至与色谱柱上部柱床水平面相同时，在色谱柱上部加入上述准备好的样品溶液（多数为水溶液），一边从色谱柱下部放出色谱柱中的原有溶剂，一边从色谱柱上部补加样品溶液，此时色谱柱的流速要适当。常用的洗脱方法是依次用水、不同浓度的乙醇或甲醇、丙酮等进行洗脱。回收溶剂，用薄层色谱进行检测，相同者合并。一般当洗脱液蒸干后留有很少残渣时，就可更换下一个洗脱剂。采用等份收集，将洗脱液用薄层色谱定性检查，根据检查结果，将成分相同的洗脱液合并。减压回收溶剂，得到分离纯化的组分。

（5）大孔吸附树脂的再生　大孔吸附树脂经再生后可反复使用。通常树脂使用以后，会在树脂表面和内部残留一些杂质，故先用乙醇将其洗至无色，再用水将乙醇洗去，即可再用。如果树脂颜色较深，可依次用水、稀酸（2%～5%）、稀碱（2%～5%）、乙醇、丙酮、水等溶剂进行洗涤或浸泡再生，直至树脂接近原颜色为宜，继而用水洗至中性，即可再用。如果树脂经过多次反复使用，致使色谱柱床挤压过紧或树脂破碎过多，影响流速和分离效果，可将树脂从色谱柱中取出，用水漂洗去太小的颗粒和悬浮的杂质，然后用乙醇等溶剂浸泡洗去杂质，再重新装柱使用。

九、离子交换色谱技术

1.离子交换色谱的简介与原理

离子交换树脂（ion exchange resin）是人工合成的高分子聚合物，由具有特殊网状结构的母核和离子交换基团组成。外观呈球形或无定形颗粒，不溶于水但可在水中膨胀。其化学结构与大孔树脂相似，区别在于其含有离子交换基团。

离子交换树脂的分离原理是利用其可解离的离子交换基团与溶液中被分离物质中的阳离子或阴离子发生交换，利用交换能力的差异分离不同类型离子化合物。化合物离子通过交换柱时的移动速率取决于与离子交换树脂的亲和力、电离程度以及溶液中各种竞争性离子的性质和浓度。

离子交换树脂的物理性能包括粒度、交联度、交换当量等指标。色谱用离子交换树脂的粒度一般为60～120目或更细。颗粒越细，达到交换平衡的速度就越快。但是若颗粒过细，则需要通过加压或减压来增大流速。交联度表示离子交换树脂中交联剂的百分含量。商品树脂的交联度范围一般为1%～16%，需根据被分离成分的性质选择。若被分离物质分子量较大，选用低交联度的树脂；分子量小，选用高交联度的树脂。一般阳离子交换树脂的交联度为8%，阴离子交换树脂的交联度为4%。交换当量表示离子交换树脂的交换能力，为每1g树脂可以交换离子的毫克摩尔数。

天然产物中有些成分具有酸性、碱性及两性基团，在水中多呈解离状态，可依据其解离度不同，采用离子交换树脂柱色谱分离，如生物碱、氨基酸、肽类、有机酸、酚类、黄酮类等成分的分离。

2.离子交换树脂的分类与选择

离子交换树脂由母核部分和离子交换部分组成。按照其离子交换基团的主要性质和类型，可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。每类树脂再根据功能基解离度不同进行细分，阳离子树脂可分为强酸型和弱酸型，阴离子树脂可分为强碱型和弱碱型。

（1）强酸型阳离子交换树脂　这类树脂含有强酸性基团，如磺酸基（—SO₃H），容易在溶液中解离出H⁺，故显强酸性。树脂解离出H⁺后，本体所含的负电基团，如S，结合溶液中的其他阳离子，完成了树脂中H⁺与溶液中阳离子的交换。强酸型树脂的解离能力很强，在酸性或碱性溶液中均能解离和产生离子交换作用。

（2）弱酸型阳离子交换树脂　这类树脂含有弱酸性基团，如羧基（—COOH），能在水中解离出H⁺而呈酸性。树脂解离后余下的负电基团，如R—COO^-，与溶液中的其他阳离子吸附结合，完成阳离子交换反应。这种树脂的酸性较弱，在低pH环境中难以解离和进行离子交换，只能在碱性、中性或微酸性溶液中（如pH=5～14）反应。

（3）强碱型阴离子交换树脂　这类树脂含有强碱性基团，如季铵基（—N⁺R₃OH），在水中离解出OH^-而呈强碱性。树脂解离出OH^-，本体所含的正电基团与溶液中的阴离子吸附结合，从而产生阴离子交换反应。这种树脂的解离性很强，在不同pH下都能正常反应。

（4）弱碱型阴离子交换树脂　这类树脂含有弱碱性基团，如伯氨基（—NH₂）、仲氨基（—NHR）或叔氨基（—NR₂），它们在水中能解离出OH^-而呈弱碱性。解离出OH^-后的正电基团与溶液中的阴离子吸附结合，完成阴离子交换反应。这种树脂需要在微碱、中性或酸性条件（如pH=1～9）下反应。

3.离子交换树脂色谱的操作技术

（1）离子交换树脂的预处理　商品离子交换树脂多以稳定的钠型或氯型存在，且含有合成时未聚合的单体、致孔剂、交联剂等杂质，因此在使用前必须经过预处理，将钠型或氯型转为H型或OH型，并除去杂质。首先将离子交换新树脂用蒸馏水浸泡1～2天，使其充分溶胀后，再装在色谱柱中按以下方法处理。

①阳离子交换树脂的预处理　该类新树脂多以稳定的钠型存在，要转为H型备用。用10倍量2mol·L^-1盐酸溶液在柱中洗脱交换，树脂转为H型，再用蒸馏水洗呈中性。然后用10倍量2mol·L^-1氢氧化钠溶液洗脱交换，转为钠型，用蒸馏水洗至中性或近中性。重复操作1～2次。最后用树脂体积10倍量2mol·L^-1盐酸溶液进行处理，使之变为H型，再用蒸馏水洗至中性，即可供备用。

②阴离子交换树脂的预处理　该类新树脂多以稳定的氯型存在，要转为OH型备用。用10倍量的2mol·L^-1氢氧化钠溶液在柱中洗脱交换，树脂转为OH型，再用蒸馏水洗呈中性。然后用10倍量2mol·L^-1盐酸溶液洗脱交换，转为氯型，用蒸馏水洗至中性或近中性。重复操作1～2次。最后用树脂体积10倍量2mol·L^-1氢氧化钠溶液进行处理，使之变为OH型，再用蒸馏水洗至中性，即可供备用。

（2）离子交换树脂的装柱　离子交换树脂通常也是以水为溶剂进行湿法装柱。其装柱方法与本节“大孔吸附树脂柱色谱技术”相似，可参考。

（3）离子交换树脂的样品交换　先将水放至与离子交换树脂色谱柱上部柱床水平面相同时，再将样品配成适当浓度的水溶液加到柱顶，以适当的流速通过离子交换树脂，直到被分离的成分全部被交换到树脂上。

（4）离子交换树脂的样品洗脱与收集　当样品溶液通过离子交换树脂柱时，亲和力强的离子先被交换而被吸附在树脂柱上，而亲和力弱的离子先被洗脱。大多数离子交换树脂通常是在水溶液或含有水的极性溶液中进行洗脱分离，为了获得最佳的洗脱效果，经常采用竞争的溶剂离子，并同时保持溶剂pH的恒定。常用的洗脱剂有强酸、强碱、盐类、不同pH的缓冲溶液等。既可以是单一浓度，也可以是梯度浓度洗脱。采用等份收集，将洗脱液用薄层色谱定性检查。根据检查结果，将成分相同的洗脱液合并。减压回收溶剂，得到分离纯化的化学成分。

（5）离子交换树脂的再生　离子交换树脂可反复使用，采用预处理的方法进行再生。离子交换树脂不用时需加水保存，保存时，阳离子树脂转为钠型，阴离子树脂转为氯型。