8 β-肾上腺素受体的调节蛋白及作用
血管疾病成为威胁人类健康的头号杀手,心血管受体在心血管疾病的发生、发展及预防和治疗中具有举足轻重的地位。β-肾上腺素受体作为G蛋白偶联受体家族的成员,是心血管药物最重要的靶点之一。β-肾上腺素受体阻滞剂被认为是继洋地黄后药物防治心脏疾病的最伟大突破,其在心血管领域的研究和应用一直是被关注的热点。2012年诺贝尔化学奖再次授予了β-肾上腺素受体的研究。随着研究的深入,人们发现β-肾上腺素受体接受着细胞内调控蛋白的精密调控,不同调控蛋白介导着受体不同的生理信号通路和病理性信号通路。基于这些发现,近年来提出了受体功能选择性的配体药物,这也将成为未来药物的研究方向。本文综述了β-肾上腺素受体调节蛋白及相关信号通路及功能。
肾上腺素受体(AR)是一类跨膜糖蛋白,它对生物机体的生长、发育、分化起着至关重要的作用。肾上腺素受体与肾上腺素、去甲肾上腺素等儿茶酚胺类神经递质结合后,可引起细胞内相应信号分子的激活,从而实现对细胞生物学功能的调控作用。随着研究的深入,人们对肾上腺素受体物种分布及亚型分类的认识日趋深刻。根据药理作用的不同,把肾上腺素受体分为α-肾上腺素受体和β-肾上腺素受体两个亚型。随着受体克隆技术及药理学技术的发展,α肾上腺素受体又被分为α1-肾上腺素受体,α2-肾上腺素受体,β-肾上腺素受体分为β1-肾上腺素受体、β2-肾上腺素受体和β3-肾上腺素受体3个亚型。
β-肾上腺素受体激动在维持正常心率(正性变时)、心肌同步(正性变传导)、心肌收缩(正性变力)及心肌能量营养代谢方面不可或缺。然而有研究表明,心脏β-肾上腺素受体持续的激动会导致心脏功能失调,心肌重塑、心律失常、心肌病、高血压、心力衰竭、心脏猝死等诸多疾病。因此,β-肾上腺素受体信号调节在心脏整个信号网络中举足轻重,了解心脏β-肾上腺素受体的信号调节至关重要。
受体作为一种跨膜蛋白将外界的各种刺激因素转化为细胞内的信号转导从而发挥生物效应。在这一过程中,信号调节蛋白起了极其重要的作用。肾上腺素受体作为G蛋白偶联受体家族成员,G蛋白是首先被发现的调节蛋白,主要包括GS和Gi。随着研究的深入,人们发现G蛋白激酶、β-arrestin也参与肾上腺素受体的调节,同时近些年来,一些新的肾上腺素受体调节蛋白逐渐被发现如14-3-3蛋白及HIP-55等。
一 β-肾上腺素受体与G蛋白
β-肾上腺素受体是G蛋白偶联受体(GPCRs)家族重要成员之一,属于7次跨膜糖蛋白,决定与配基结合特性的部位在跨膜区域内,而决定与G蛋白偶联进而引起信号传递的部位主要存在于第三细胞内环。β-肾上腺素受体与配体结合后,依据偶联的G蛋白亚型不同,产生不同的生物学效应。经典的GPCR信号转导遵循GPCR-G蛋白-效应分子信号途径。与配体结合的G蛋白偶联受体发生构象变化,从而表现出鸟苷酸交换因子(GEF)的特性,通过以三磷酸鸟苷(GTP)交换G蛋白上结合着的二磷酸鸟苷(GDP),使G蛋白的α亚基与β、γ亚基分离。这一过程使得G蛋白的α亚基变为激活状态,并参与下一步的信号传递过程。具体的传递通路取决于α亚基的种类(Gαs、Gαi/o、Gαq/11和Gα12/13)(表1-8-1),其中两个主要的通路(Gs和Gi通路)分别涉及第二信使环腺苷酸(cAMP)和磷脂酰肌醇。β2-肾上腺素受体只激活Gαs通路,Gαs被激活后,其下游的cAMP水平升高,升高的cAMP可以通过激活蛋白激酶A(PKA)传递下游信号,同时还可以通过Epac/Rap1通路介导cAMP依赖、PKA非依赖性生物学效应。β1-肾上腺素受体既可激活Gs通路,也可激活Gi通路,Gαi激活后,它一方面可通过其Gαi亚基抑制Gαs的作用,另一方面可通过Gβγ/PT3K/AKT传递下游信号。同时,还有研究表明,β2-肾上腺素受体可以通过Gα15和Gα16激活磷脂酶C。由此可见,G蛋白是β-肾上腺素受体生物学效应的重要介导和调节蛋白质。
表1-8-1 G蛋白α亚基分类及特征
β-AR:β-肾上腺素受体;α2-AR:α2-肾上腺素受体;Musc:毒蕈碱胆碱能受体;Rho:视紫红质;AC:腺苷酸环化酶;PDE:磷酸二酯酶;PLC:磷脂酶C
二 β肾上腺受体与G蛋白激酶(GRK)
在外界的刺激作用下,β-肾上腺素受体会发生一系列的改变。这些变化包括受体减敏(desensitization)、内化(internalization)、下调(downregulation)、内吞(endocytosis)、隔离(Sequestration)及复敏(resensitization)等。受体发生的这些生物效应都是在相应的蛋白激酶作用下完成的。β-肾上腺素受体可以在受体、G蛋白及效应分子等不同水平上产生减敏效应,而GRK调节的减敏是β-肾上腺素受体减敏的最主要方式,这个过程可发生在β-肾上腺素受体激动后的几毫秒到几分钟之间。GRKs最早是在观察β2-肾上腺素受体及视紫红质的减敏过程中发现的,至今,GRK家族一共发现有7个成员(表1-8-2)。GRKs家族成员具有共同的结构特征,它们都含有中间催化结构域及两端的氨基末端和羧基末端。而根据序列及组织分布及功能特性,GRKs家族成员被分为GRK1、GRK2、GRK4三个亚家族。GRK1亚家族包括GRK1和GRK7,它们特异分布于视网膜组织中,GRK2亚家族包括GRK2和GRK3,它们广泛分布于各组织,GRK4亚家族包括GRK4,GRK5,GRK6,其中GRK4主要分布在睾丸及肾组织中,而GRK5,GRK6则在各组织广泛分布。
表1-8-2 GRK分型及其功能比较
续表
HEK293:人胚肾293细胞;β-AR:β-肾上腺素受体;α1-AR:α1-肾上腺素受体;M2musc:M2型胆碱能受体;CXC4:趋化因子共受体4
GRKs在调节β-肾上腺素受体生物学效应中发挥着重要的作用,能够使配体激活的受体发生磷酸化,使受体与G蛋白失偶联,从而减弱受体下游效应。β-肾上腺素受体减敏效应对机体尤其是心脏的作用较为复杂。有研究表明,在过表达GRK2的小鼠模型中心脏收缩能力是下降的,抑制GRK2能抑制心脏肥厚,改善心脏血流动力学,提高小鼠生存率,防止心肌梗死后心力衰竭的发生。其作用可能与抑制GRK2后心肌细胞表面β-肾上腺素受体数量增加,心脏肥大被抑制及机体耐受力提高有关,而抑制GRK3能够改善压力负荷导致的心脏功能失调。然而,有些研究表明,敲除GRK2能使小鼠胚胎发育延缓并能增加胚胎致死率。心脏特异性敲除GRK2不影响心脏的发育,但心室的发育严重受损,心脏对慢性儿茶酚胺刺激毒性反应增强。综上所述,GRKs在调节β-肾上腺素受体生物效应中作用较为复杂,有待深入研究。
三 β肾上腺受体与β-arrestins
传统观点认为,β-肾上腺素受体主要是通过依赖于G蛋白的经典信号通路发挥作用,配体激活β-肾上腺素受体,进而激活偶联的G蛋白,使细胞内的第二信使物质增加,从而激活下游的靶激酶,导致相应的生物学效应。随着分子生物学研究的深入,研究发现,β-arrestin作为细胞内的信号调节蛋白在调控β-肾上腺素受体信号通路中发挥着重要的作用,而且研究发现,β-arrestin通过非G蛋白依赖的信号通路调控β-肾上腺素受体信号。
在哺乳动物中,arrestin家族有4个成员,它们分别是arrestin1(视锥或杆状arrestin,也叫S-抗原或48kD蛋白),主要分布在视网膜视杆或视锥细胞中;arrestin2又称为β-arrestin或β-arrestin1,在各组织中广泛分布;arrestin3或称为β-arrestin2,也广泛分布于各组织中;arrestin4(视锥arrestin或X-arrestin)特异存在于视网膜视锥细胞中。晶体结构分析显示,arrestin分子结构在物种中存在高度的保守性,包含两个结构域,即羧基末端结构域和氨基末端结构,在羧基末端还连有一个羧基末端尾巴,它与氨基端存在着紧密连接作用。羧基末端结构域和氨基末端结构域形成反向平行的β折叠,静息状态下,两者在分子间的相互作用力下形成紧密的扣状结构。而当其与磷酸化受体结合后则会发生分子构象的改变,紧密扣状型结构解开同时羧基末端尾巴解离,两个结构域彼此靠近同时与细胞内相应受体环相互作用启动下游信号。
近年来,β-arrestin对β-肾上腺素受体信号的调控已成为研究的热点。有研究发现,在未受激动剂作用的细胞中β-arrestin是以磷酸化形式存在于细胞质中,当β-肾上腺素受体与激动剂结合后,β-肾上腺素受体发生磷酸化,磷酸化的β2-肾上腺素受体(β-AR)募集β-arrestin1并使其去磷酸化,去磷酸化的β-arrestin1与clathrin结合形成clathrin包被的受体囊泡,同时β-arrestin1作为桥梁蛋白募集细胞内的dynamin等蛋白对受体囊泡进行剪切,从而导致受体的内化,降解或复敏。此外,β-arrestins在受体细胞内运输及触发新的信号通路中具有重要作用。在皮肤角质层细胞中,β-arrestin在抑制β-肾上腺素受体经典信号通路的同时可激活ERK MAPK信号通路。作者的研究也发现,异丙基肾上腺素(ISO)可诱导人胚肾293A细胞p38MAPK信号通路的双相激活,β-arrestin-1介导了p38MAPK信号通路的早期激活。在整体功能方面,有研究发现β-arrestin1基因敲除小鼠的心脏对交感神经的刺激作用更为敏感;同时临床心力衰竭患者应用多巴酚丁胺后会出现药物耐受情况,但在药物特异性抑制β-arrestin的作用后,这种药物耐受情况有所减轻。机制研究表明这些现象与β-arrestin介导的β-肾上腺素受体内化、减敏有关;另有研究发现,β-arrestin可通过介导HB-EGF的剪切转位激活EGFR减轻心脏对慢性儿茶酚胺类神经递质的毒性作用,提示β-arrestin对心血管疾病患者的保护作用(图1-8-1)。然而,也有研究表明,β-肾上腺素受体抑制剂美托洛尔可以通过arrestin2介导小鼠心脏纤维化,敲除β-arrestin2能够抑制β1-AR激活导致的心肌细胞肥大,这些研究表明β-arrestin通过β-肾上腺素受体对心脏进行负性调控。综上,β-arrestin对β-肾上腺素受体的信号调控复杂而精细。
图1-8-1 β-arrestin介导的β-AR信号通路图
四 β肾上腺受体与14-3-3蛋白
14-3-3蛋白,最早是由Moore等人于1967年为寻找在大脑组织中特异表达的蛋白而发现,并根据DEAE-cellulose chromatography和电泳分离时它出现的位置而命名。14-3-3在体内以同源或异源二聚体的形式存在,形成了一个成U型结构的空间构象。作为接头蛋白,研究发现,在哺乳动物细胞中有多达200多种蛋白可以通过特异的氨基酸序列识别该U型结构,与14-3-3形成复合体。14-3-3蛋白通过与一些酶或者结构蛋白等多种靶蛋白结合,在细胞周期调控、增殖、细胞生长、精子的生成、细胞骨架重排以及细胞凋亡等方面起着重要作用。通过与靶蛋白结合,14-3-3蛋白可以改变靶蛋白与其他蛋白的相互作用,或者改变靶蛋白的亚细胞分布,或者增强或抑制靶蛋白的酶活性,或者保护靶蛋白不被降解或去磷酸化,通过这些作用14-3-3蛋白在生命活动中扮演着重要角色。
近年来研究表明,14-3-3蛋白可以直接或间接调控β-肾上腺素受体信号通路。14-3-3蛋白可以通过与G蛋白信号调节蛋白(RGS)、arrestin、Spinophilin等蛋白相互作用来调节β1-AR对Na-K-ATPase的影响,从而调节细胞内的K离子流,进而影响心肌细胞动作电位时程。同时前期研究发现14-3-3能够负性调节心肌细胞对去甲肾上腺素(NE)刺激因素的反应,其机制与14-3-3蛋白对PI3K/PKB/GSK3β和NFAT信号通路的调节有关。其中14-3-3对GSK3β的磷酸化和NFAT在细胞内的分布可能起到关键的作用。另外,Limbird LE等研究发现14-3-3ζ可以与α2-肾上腺素受体第三胞内环结合介导受体在膜上的滞留作用实现对受体分布及信号转导的调控作用。
五 新发现的β肾上腺素受体调节蛋白
随着β-肾上腺素受体调节研究的深入,β-肾上腺素受体信号调节网络也愈来愈清晰,新的β-肾上腺素受体调节蛋白也不断被发现。
(一)β肾上腺受体与HIP-55
造血祖细胞激酶1相互作用蛋白(HIP-55)是一个分子量为55kD大小的蛋白质,因其在哺乳动物中能与F-肌动蛋白(F-actin)相结合又称为哺乳动物F-actin结合蛋白1(mAbp1),研究发现,HIP-55对机体多种生物功能均有调节作用。在器官发育方面,HIP-55缺陷小鼠表现器官发育的异常。在免疫功能方面,它与中性粒细胞的趋化、聚集、游走及T淋巴细胞、B淋巴细胞的发育、活化及细胞因子的分泌密切相关。作者所在课题组首次发现了HIP-55在心脏中的功能,HIP-55能够在单细胞水平上抑制心肌细胞的收缩力。HIP-55在β-肾上腺素受体介导的心脏重塑中表达明显上调,上调的HIP-55能够负性调控β-肾上腺素受体介导的心脏成纤维细胞的增殖。在心脏成纤维细胞中,HIP-55还能够抑制异丙肾上腺素ISO诱导的活性氧自由基的产生。这些结果,提示了HIP-55作为一种新的信号接头蛋白能够负性调控β-肾上腺素受体的信号及功能。
(二)β肾上腺受体与endophilin
内吞蛋白(endophilin)是一个具有Bin/Amphiphysin/Rvs(BAR)结构域家族的蛋白,它分布于胞质中并形成异源二聚体结构。除此之外,它还含有一个可变区和SH3结构域。研究表明,endophilin主要参与突触囊泡的内吞,受体的内化、转运及细胞的凋亡和自噬。此外,endophilin还参与clathrin依赖的细胞内吞途径,有助于足细胞足突的形成。同时相关研究发现,endophilin能够促进β1肾上腺素受体(β1-AR)的内化,从而下调β1-AR介导的经典Gs信号效应。
(三)β肾上腺受体与Amyloid β-peptide
Amyloid β-peptide(Aβ)是一个仅含有40~42个氨基酸的分子量为4kD的小分子片段,主要与阿尔茨海默病(AD)相关。在AD小鼠脑组织中,Aβ含量上调,相关研究表明Aβ可能通过氧化应激、炎性反应途径导致脑神经元的退行性改变。然而,近年来研究发现,在成纤维及前额皮层神经元细胞中,Aβ能够介导β2-AR的减敏、内化及降解,从而下调β2-AR的生物学功能,这一过程有赖于GRK介导的β2-AR磷酸化及arrestin、dynamin的调节作用。
六 总结和展望
心血管受体在心血管疾病的发生、发展及预防和治疗中具有举足轻重的地位。β-肾上腺素受体作为G蛋白偶联受体家族成员,是最重要的心血管受体,同时也是心血管药物最重要的靶点之一。β-肾上腺素受体阻滞剂的发现和临床应用被视为20世纪药物治疗学上里程碑式的进展,是药物防治心脏疾病的最伟大突破。很多心血管药物都以β-AR为靶点。近年来,随着受体调控机制研究的不断深入,药物研究从以受体本身为靶点,发展为选择针对受体下游信号通路为靶点,即筛选能够抑制β-AR过度激活介导的病理性信号通路和功能,同时保留受体介导的正常生理性信号通路和功能的药物,由此提出了功能选择性受体药物的概念。显然,以受体信号精密调节为基础的受体功能选择性的药物将成为未来药物的重要研究方向。同时,β肾上腺素受体信号精密调节的深入研究,也将为指导以心血管疾病为首的临床疾病的治疗产生深远意义。
(田爱炬 李子健)
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